Хетерогеност на човечките скелетни мускулни влакна надвор од тешкиот ланец на миозинот

Ви благодариме што ја посетивте страницата nature.com. Верзијата на прелистувачот што ја користите има ограничена поддршка за CSS. За најдобро искуство, препорачуваме да ја користите најновата верзија на прелистувачот (или да го оневозможите режимот на компатибилност во Internet Explorer). Дополнително, за да се обезбеди континуирана поддршка, оваа страница ќе биде ослободена од стилови и JavaScript.
Скелетниот мускул е хетерогено ткиво составено претежно од миофибрили, кои кај луѓето обично се класифицираат во три типа: еден „бавен“ (тип 1) и два „брзи“ (типови 2А и 2X). Сепак, хетерогеноста помеѓу и во рамките на традиционалните типови на миофибрили останува слабо разбрана. Применивме транскриптомски и протеомски пристапи на 1050 и 1038 индивидуални миофибрили од човечки vastus lateralis, соодветно. Протеомската студија вклучуваше мажи, а транскриптомската студија вклучуваше 10 мажи и 2 жени. Покрај изоформите на тешкиот ланец на миозин, идентификувавме метаболички протеини, рибозомални протеини и клеточни споени протеини како извори на мултидимензионална варијабилност на интермиофибрилите. Понатаму, и покрај идентификацијата на кластери на бавни и брзи влакна, нашите податоци сугерираат дека влакната од тип 2X се фенотипски неразлични од другите брзо-контрагирачки влакна. Понатаму, класификацијата базирана на тешкиот ланец на миозин е недоволна за да го опише фенотипот на миофибер кај немалинските миопатии. Генерално, нашите податоци укажуваат на повеќедимензионална хетерогеност на миофиберите, со извори на варијација што се протегаат надвор од изоформите на тешкиот ланец на миозинот.
Клеточната хетерогеност е вродена карактеристика на сите биолошки системи, дозволувајќи им на клетките да се специјализираат за да ги задоволат различните потреби на ткивата и клетките.1 Традиционалниот поглед на хетерогеноста на скелетните мускулни влакна е дека моторните неврони го дефинираат типот на влакна во рамките на моторната единица и дека типот на влакна (т.е. тип 1, тип 2А и тип 2X кај луѓето) е определен од карактеристиките на изоформите на тешкиот ланец на миозин (MYH).2 Ова првично се базираше на нивната pH ATPase нестабилност,3,4 а подоцна на нивната молекуларна експресија на MYH.5 Сепак, со идентификацијата и последователното прифаќање на „мешани“ влакна кои коекспресираат повеќе MYH во различни пропорции, скелетните мускулни влакна сè повеќе се сметаат за континуум, а не како различни типови влакна.6 И покрај ова, полето сè уште во голема мера се потпира на MYH како примарен класификатор за класификација на миофили, поглед веројатно под влијание на ограничувањата и значајните пристрасности на раните студии на глодари чии профили на експресија на MYH и опсег на типови влакна се разликуваат од оние кај луѓето.2 Ситуацијата е дополнително комплицирана од фактот дека различните човечки скелетни мускули покажуваат разновиден опсег на типови влакна.7 vastus lateralis е мешан мускул со среден (и затоа репрезентативен) профил на експресија на MYH.7 Понатаму, леснотијата на земање примероци го прави најдобро проучен мускул кај луѓето.
Според тоа, непристрасното истражување на разновидноста на скелетните мускулни влакна со употреба на моќни алатки „омика“ е критично, но исто така и предизвикувачко, делумно поради повеќејадрената природа на скелетните мускулни влакна. Сепак, технологиите за транскриптомика8,9 и протеомика10 претрпеа револуција во чувствителноста во последниве години поради различните технолошки достигнувања, овозможувајќи анализа на скелетните мускули со резолуција на единечни влакна. Како резултат на тоа, постигнат е значителен напредок во карактеризирањето на разновидноста на единечни влакна и нивниот одговор на атрофични стимули и стареење11,12,13,14,15,16,17,18. Важно е да се напомене дека овие технолошки достигнувања имаат клинички примени, овозможувајќи подетална и прецизна карактеризација на дисрегулацијата поврзана со болести. На пример, патофизиологијата на немалинската миопатија, една од најчестите наследни мускулни заболувања (MIM 605355 и MIM 161800), е комплексна и збунувачка.19,20 Затоа, подобрата карактеризација на дисрегулацијата на скелетните мускулни влакна би можела да доведе до значителен напредок во нашето разбирање на оваа болест.
Развивме методи за транскриптомска и протеомска анализа на единечни скелетни мускулни влакна рачно изолирани од примероци од човечка биопсија и ги применивме на илјадници влакна, овозможувајќи ни да ја испитаме клеточната хетерогеност на човечките скелетни мускулни влакна. Во текот на оваа работа, ја демонстриравме моќта на транскриптомското и протеомското фенотипизирање на мускулните влакна и ги идентификувавме метаболните, рибозомските и клеточните спојни протеини како значајни извори на варијабилност меѓу влакната. Понатаму, користејќи го овој протеомски работен тек, ја карактеризиравме клиничката релевантност на нематодната миопатија кај единечни скелетни мускулни влакна, откривајќи координирано поместување кон неоксидативни влакна независно од типот на влакно врз основа на MYH.
За да ја истражиме хетерогеноста на човечките скелетни мускулни влакна, развивме два работни тека за да овозможиме анализа на транскриптом и протеом на единечни скелетни мускулни влакна (Слика 1А и Дополнителна слика 1А). Развивме и оптимизиравме неколку методолошки чекори, од складирање на примероци и зачувување на интегритетот на РНК и протеините до оптимизирање на протокот за секој пристап. За анализа на транскриптом, ова беше постигнато со вметнување на молекуларни баркодови специфични за примерокот во почетниот чекор на обратна транскрипција, овозможувајќи 96 влакна да се соберат за ефикасна обработка низводно. Подлабокото секвенционирање (±1 милион читања по влакно) во споредба со традиционалните пристапи со единечни клетки дополнително ги збогати транскриптомските податоци.21 За протеомика, користевме краток хроматографски градиент (21 минута) во комбинација со DIA-PASEF собирање податоци на масен спектрометар timsTOF за да ја оптимизираме длабочината на протеомот, а воедно да одржиме висок проток. 22,23 За да ја испитаме хетерогеноста на здравите скелетни мускулни влакна, ги карактеризиравме транскриптомите на 1.050 индивидуални влакна од 14 здрави возрасни донори и протеомите на 1.038 влакна од 5 здрави возрасни донори (Дополнителна табела 1). Во овој труд, овие бази на податоци се нарекуваат транскриптоми и протеоми од 1.000 влакна, соодветно. Нашиот пристап откри вкупно 27.237 транскрипти и 2.983 протеини во транскриптомските и протеомските анализи од 1.000 влакна (Слика 1А, Дополнителни бази на податоци 1-2). По филтрирањето на транскриптомските и протеомските бази на податоци за >1.000 откриени гени и 50% валидни вредности по влакно, последователни биоинформатички анализи беа извршени за 925 и 974 влакна во транскриптомот и протеомот, соодветно. По филтрирањето, просечно 4257 ± 1557 гени и 2015 ± 234 протеини (просек ± SD) беа откриени по влакно, со ограничена варијабилност меѓу поединците (Дополнителни слики 1B–C, Дополнителни сетови на податоци 3–4). Сепак, варијабилноста во рамките на субјектот беше поизразена кај учесниците, веројатно поради разликите во приносот на РНК/протеин помеѓу влакната со различни должини и површини на пресек. За повеќето протеини (>2000), коефициентот на варијација беше под 20% (Дополнителна слика 1D). И двата методи овозможија снимање на широк динамички опсег на транскрипти и протеини со високо изразени потписи важни за мускулната контракција (на пр., ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Дополнителни слики 1E–F). Повеќето од идентификуваните карактеристики беа заеднички помеѓу транскриптомските и протеомските сетови на податоци (Дополнителна слика 1G), а средните интензитети на UMI/LFQ на овие карактеристики беа релативно добро корелирани (r = 0,52) (Дополнителна слика 1H).
Работен тек за транскриптомика и протеомика (креирано со BioRender.com). BD Криви на динамички опсег за MYH7, MYH2 и MYH1 и пресметани прагови за доделување на тип на влакна. E, F Распределба на експресијата на MYH низ влакната во множества податоци за транскриптомика и протеомика. G, H Графикони за апроксимација и проекција на униформна разновидност (UMAP) за транскриптомика и протеомика обоени според типот на влакна базирани на MYH. I, J Карактеристични дијаграми кои ја прикажуваат експресијата на MYH7, MYH2 и MYH1 во множества податоци за транскриптомика и протеомика.
Првично, се стремиме да доделиме тип на влакно базиран на MYH на секое влакно користејќи оптимизиран пристап кој ја користи високата чувствителност и динамичкиот опсег на експресијата на MYH во омичните податочни множества. Претходните студии користеа произволни прагови за означување на влакната како чист тип 1, тип 2A, тип 2X или мешани врз основа на фиксен процент на експресија на различни MYH11,14,24. Користевме различен пристап во кој експресијата на секое влакно беше рангирана според MYH-ите што ги користевме за типизирање на влакната: MYH7, MYH2 и MYH1, што одговараат на влакна од тип 1, тип 2A и тип 2X, соодветно. Потоа математички ја пресметавме долната точка на инфлексија на секоја добиена крива и ја користевме како праг за да ги доделиме влакната како позитивни (над прагот) или негативни (под прагот) за секој MYH (Слика 1B–D). Овие податоци покажуваат дека MYH7 (Слика 1B) и MYH2 (Слика 1C) имаат поизразени профили на експресија вклучено/исклучено на ниво на РНК во споредба со нивото на протеини. Всушност, на ниво на протеини, многу малку влакна не го експресираа MYH7, а ниедно влакно немаше 100% експресија на MYH2. Потоа користевме претходно одредени прагови на експресија за да ги доделиме типовите влакна базирани на MYH на сите влакна во секој збир на податоци. На пример, влакната MYH7+/MYH2-/MYH1- беа доделени на тип 1, додека влакната MYH7-/MYH2+/MYH1+ беа доделени на мешан тип 2A/2X (видете ја Дополнителната Табела 2 за целосен опис). Со комбинирање на сите влакна, забележавме извонредно слична дистрибуција на типовите влакна базирани на MYH на ниво на РНК (Слика 1E) и протеин (Слика 1F), додека релативниот состав на типовите влакна базирани на MYH варираше кај поединците, како што се очекуваше (Дополнителна Слика 2A). Повеќето влакна беа класифицирани како чист тип 1 (34–35%) или тип 2A (36–38%), иако беше откриен и значителен број на мешани влакна од тип 2A/2X (16–19%). Впечатлива разлика е што чистите влакна од тип 2X можат да се детектираат само на ниво на РНК, но не и на ниво на протеини, што укажува дека брзата експресија на MYH е барем делумно регулирана пост-транскрипциски.
Го валидиравме нашиот метод за типизирање на MYH влакна базиран на протеомика користејќи точкасто блотирање базирано на антитела, и двата методи постигнаа 100% согласност во идентификувањето на чисти влакна тип 1 и тип 2А (видете ја Дополнителната слика 2Б). Сепак, пристапот базиран на протеомика беше почувствителен, поефикасен во идентификувањето на мешани влакна и квантификувањето на процентот на секој MYH ген во секое влакно. Овие податоци ја демонстрираат ефикасноста на користењето на објективен, високо чувствителен пристап базиран на омика за карактеризирање на типовите на скелетни мускулни влакна.
Потоа ги користевме комбинираните информации обезбедени од транскриптомијата и протеомијата за објективно класифицирање на миофилките врз основа на нивниот целосен транскриптом или протеом. Користејќи го методот на униформна многуобразна апроксимација и проекција (UMAP) за да ја намалиме димензионалноста на шест главни компоненти (Дополнителни слики 3A–B), бевме во можност да ја визуелизираме варијабилноста на миофилките во транскриптомот (Слика 1G) и протеомот (Слика 1H). Имено, миофилките не беа групирани според учесниците (Дополнителни слики 3C–D) или деновите на тестирање (Дополнителна слика 3E) ниту во множествата податоци за транскриптомијата ниту во протеомијата, што укажува дека варијабилноста на скелетните мускулни влакна во рамките на субјектот е поголема отколку варијабилноста меѓу субјектите. Во графиконот UMAP, се појавија два различни кластери што претставуваат „брзи“ и „бавни“ миофилки (Слики 1G–H). MYH7+ (бавни) миофилки беа групирани на позитивниот пол на UMAP1, додека MYH2+ и MYH1+ (брзи) миофилки беа групирани на негативниот пол на UMAP1 (слики 1I–J). Сепак, не беше направена разлика помеѓу типовите на брзо-контрактивни влакна (т.е. тип 2A, тип 2X или мешан 2A/2X) врз основа на експресијата на MYH, што сугерира дека експресијата на MYH1 (слика 1I–J) или други класични маркери на миофилки 2X како што се ACTN3 или MYLK2 (дополнителни слики 4A–B) не прави разлика помеѓу различните типови на миофилки кога се разгледува целиот транскриптом или протеом. Покрај тоа, во споредба со MYH2 и MYH7, малку транскрипти или протеини беа позитивно корелирани со MYH1 (дополнителни слики 4C–H), што сугерира дека изобилството на MYH1 не го одразува целосно транскриптомот/протеомот на миофилкот. Слични заклучоци беа донесени при проценка на мешаната експресија на трите MYH изоформи на UMAP ниво (Дополнителни слики 4I–J). Така, додека 2X влакна можат да се идентификуваат на ниво на транскрипт само врз основа на квантификација на MYH, MYH1+ влакната не се разликуваат од другите брзи влакна кога се разгледува целиот транскриптом или протеом.
Како почетно истражување на хетерогеноста на бавните влакна надвор од MYH, проценивме четири воспоставени протеини специфични за типот на бавни влакна: TPM3, TNNT1, MYL3 и ATP2A22. Подтиповите на бавни влакна покажаа високи, иако не совршени, Пирсонови корелации со MYH7 и во транскриптомијата (Дополнителна слика 5А) и во протеомијата (Дополнителна слика 5Б). Приближно 25% и 33% од бавните влакна не беа класифицирани како чисти бавни влакна според сите подтипови на гени/протеини во транскриптомијата (Дополнителна слика 5C) и протеомијата (Дополнителна слика 5D), соодветно. Затоа, класификацијата на бавните влакна врз основа на повеќе подтипови на гени/протеини воведува дополнителна сложеност, дури и за протеини за кои се знае дека се специфични за типот на влакна. Ова сугерира дека класификацијата на влакната врз основа на изоформи на едно семејство на гени/протеини можеби не ја одразува соодветно вистинската хетерогеност на скелетните мускулни влакна.
За понатамошно истражување на фенотипската варијабилност на човечките скелетни мускулни влакна на ниво на целиот омичен модел, извршивме непристрасно намалување на димензионалноста на податоците користејќи анализа на главни компоненти (PCA) (Слика 2А). Слично на UMAP дијаграмите, ниту учесникот ниту денот на тестирање не влијаеја на групирањето на влакната на ниво на PCA (Дополнителни слики 6А-C). Во двата сета на податоци, типот на влакна базиран на MYH беше објаснет со PC2, кој покажа кластер на бавно грчеви тип 1 влакна и втор кластер што содржи брзо грчеви тип 2А, тип 2X и мешани 2A/2X влакна (Слика 2А). Во двата сета на податоци, овие два кластера беа поврзани со мал број мешани влакна тип 1/2A. Како што се очекуваше, анализата на презастапеност на главните PC двигатели потврди дека PC2 е управуван од контрактилни и метаболички потписи (Слика 2Б и Дополнителни слики 6D-E, Дополнителни сетови на податоци 5-6). Генерално, се покажа дека типот на влакна базиран на MYH е доволен за да се објасни континуираната варијација долж PC2, со исклучок на таканаречените 2X влакна кои беа дистрибуирани низ целиот транскриптом во рамките на брзиот кластер.
A. Графикони со анализа на главни компоненти (PCA) на множества податоци за транскриптом и протеом обоени според типот на влакно врз основа на MYH. B. Анализа на збогатување на двигателите на транскриптот и протеините во PC2 и PC1. Статистичката анализа е извршена со користење на пакетот clusterProfiler и p-вредности прилагодени од Benjamini-Hochberg. C, D. Графикони со PCA обоени според термините на онтологијата на генот за меѓуклеточна адхезија (GO) во GO термините на транскриптомот и костамерот во протеомот. Стрелките ги претставуваат двигателите на транскриптот и протеините и нивните насоки. E, F. Графикони со карактеристики на униформна многуобразна апроксимација и проекција (UMAP) на клинички релевантни карактеристики што покажуваат градиенти на експресија независно од типот на бавно/брзо влакно. G, H. Корелации помеѓу двигателите на PC2 и PC1 во транскриптомите и протеомите.
Неочекувано, типот на миофибер базиран на MYH го објасни само вториот највисок степен на варијабилност (PC2), што укажува дека други биолошки фактори кои не се поврзани со типот на миофибер базиран на MYH (PC1) играат важна улога во регулирањето на хетерогеноста на скелетните мускулни влакна. Анализата на презастапеност на главните двигатели во PC1 откри дека варијабилноста во PC1 е првенствено одредена од адхезијата клетка-клетка и содржината на рибозоми во транскриптомот, како и од костамерите и рибозомалните протеини во протеомот (Слика 2B и Дополнителни слики 6D–E, Дополнителен сет на податоци 7). Во скелетните мускули, костамерите го поврзуваат Z-дискот со сарколемата и се вклучени во преносот на силата и сигнализацијата. 25 Анотираните PCA графикони со користење на карактеристики на адхезија клетка-клетка (транскриптом, Слика 2C) и костамер (протеом, Слика 2D) открија силно поместување налево во PC1, што укажува дека овие карактеристики се збогатени кај одредени влакна.
Подетално испитување на групирањето на миофиберите на ниво на UMAP покажа дека повеќето карактеристики покажуваат градиент на експресија базиран на MYH, независен од типот на миофибер, наместо специфичен за подкластерот на миофибер. Овој континуитет беше забележан кај неколку гени поврзани со патолошки состојби (Слика 2E), како што се CHCHD10 (невромускулна болест), SLIT3 (мускулна атрофија), CTDNEP1 (мускулна болест). Овој континуитет беше забележан и низ протеомот, вклучувајќи протеини поврзани со невролошки нарушувања (UGDH), инсулинска сигнализација (PHIP) и транскрипција (HIST1H2AB) (Слика 2F). Заедно, овие податоци укажуваат на континуитет во хетерогеноста на бавно/брзо грчење, независна од типот на влакна, низ различни миофибери.
Интересно е што гените-двигатели во PC2 покажаа добра транскриптом-протеом корелација (r = 0,663) (Слика 2G), што укажува дека типовите на бавно и брзо-треперливи влакна, а особено контрактилните и метаболичките својства на скелетните мускулни влакна, се транскрипционо регулирани. Сепак, гените-двигатели во PC1 не покажаа транскриптом-протеом корелација (r = -0,027) (Слика 2H), што укажува дека варијациите што не се поврзани со типовите на бавно/брзо-треперливи влакна се во голема мера регулирани пост-транскрипционо. Бидејќи варијациите во PC1 првенствено беа објаснети со термини на онтологијата на рибозомските гени, и со оглед на тоа што рибозомите играат клучна и специјализирана улога во клетката со активно учество и влијание врз транслацијата на протеините,31 следно се залагаме да ја истражиме оваа неочекувана рибозомска хетерогеност.
Прво го обоивме графиконот за анализа на главните компоненти на протеомика според релативната изобилство на протеини во терминот GOCC „цитоплазматски рибозом“ (Слика 3А). Иако овој термин е збогатен на позитивната страна на PC1, што резултира со мал градиент, рибозомските протеини го поттикнуваат партиционирањето во двата правци на PC1 (Слика 3А). Рибозомските протеини збогатени на негативната страна на PC1 вклучуваат RPL18, RPS18 и RPS13 (Слика 3Б), додека RPL31, RPL35 и RPL38 (Слика 3В) беа главните двигатели на позитивната страна на PC1. Интересно е што RPL38 и RPS13 беа високо експресирани во скелетните мускули во споредба со другите ткива (Дополнителна слика 7А). Овие карактеристични рибозомски потписи во PC1 не беа забележани во транскриптомот (Дополнителна слика 7Б), што укажува на пост-транскрипциска регулација.
A. График на анализа на главните компоненти (PCA) обоен според термините на цитоплазматската рибозомална генска онтологија (GO) низ протеомот. Стрелките ја покажуваат насоката на протеински-посредуваната варијација во PCA графиконот. Должината на линијата одговара на резултатот од главните компоненти за даден протеин. B, C. Графикони на карактеристики на PCA за RPS13 и RPL38. D. Ненадгледувана хиерархиска анализа на групирање на цитоплазматски рибозомални протеини. E. Структурен модел на 80S рибозомот (PDB: 4V6X) кој ги истакнува рибозомалните протеини со различна застапеност во скелетните мускулни влакна. F. Рибозомални протеини со различна стехиометрија локализирани во близина на излезниот канал на mRNA.
Концептите на рибозомска хетерогеност и специјализација се предложени претходно, при што присуството на различни рибозомски подпопулации (рибозомска хетерогеност) може директно да влијае на транслацијата на протеини во различни ткива32 и клетки33 преку селективна транслација на специфични пулови на транскрипти на mRNA34 (специјализација на рибозоми). За да идентификуваме подпопулации на рибозомски протеини кои се ко-експресирани во скелетните мускулни влакна, извршивме ненадгледувана хиерархиска анализа на групирање на рибозомски протеини во протеомот (Слика 3D, Дополнителен сет на податоци 8). Како што се очекуваше, рибозомските протеини не се групираа според типот на влакно врз основа на MYH. Сепак, идентификувавме три различни кластери на рибозомски протеини; првиот кластер (ribosomal_cluster_1) е корегулиран со RPL38 и затоа има зголемена експресија во влакна со позитивен PC1 профил. Вториот кластер (ribosomal_cluster_2) е корегулиран со RPS13 и е покачен во влакна со негативен PC1 профил. Третиот кластер (ribosomal_cluster_3) не покажува координирана диференцијална експресија во скелетните мускулни влакна и може да се смета за „јадро“ на рибозомалниот протеин на скелетните мускули. И двата рибозомални кластери 1 и 2 содржат рибозомални протеини за кои претходно е покажано дека ја регулираат алтернативната транслација (на пр., RPL10A, RPL38, RPS19 и RPS25) и функционално влијаат на развојот (на пр., RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 Во согласност со резултатите од PCA, набљудуваната хетерогена репрезентација на овие рибозомални протеини низ влакната, исто така, покажа континуитет (Дополнителна слика 7C).
За да ја визуелизираме локацијата на хетерогените рибозомални протеини во рибозомот, користевме структурен модел на човечкиот 80S рибозом (Protein Data Bank: 4V6X) (Слика 3E). По изолирањето на рибозомалните протеини кои припаѓаат на различни рибозомални кластери, нивните локации не беа тесно усогласени, што укажува дека нашиот пристап не успеа да обезбеди збогатување за одредени региони/фракции на рибозомот. Интересно е, сепак, што процентот на големи протеини на подгрупите во кластерот 2 беше помал отколку во кластерите 1 и 3 (Дополнителна слика 7D). Забележавме дека протеините со изменета стехиометрија во скелетните мускулни влакна беа претежно локализирани на површината на рибозомот (Слика 3E), во согласност со нивната способност да комуницираат со елементите на внатрешното место за влез на рибозомот (IRES) во различни популации на mRNA, со што се координира селективната транслација. 40, 41 Понатаму, многу протеини со изменета стехиометрија во скелетните мускулни влакна беа лоцирани во близина на функционални региони како што е излезниот тунел на mRNA (Слика 3F), кои селективно го регулираат транслациското издолжување и запирањето на специфични пептиди. 42 Накратко, нашите податоци укажуваат дека стехиометријата на рибозомалните протеини на скелетните мускули покажува хетерогеност, што резултира со разлики помеѓу скелетните мускулни влакна.
Потоа се насочивме кон идентификување на потписи на брзо- и бавно-контрактивни влакна и истражување на механизмите на нивната транскрипциска регулација. Споредувајќи ги кластерите на брзо- и бавно-контрактивни влакна дефинирани од UMAP во двата сета на податоци (слики 1G–H и 4A–B), транскриптомските и протеомските анализи идентификуваа 1366 и 804 различно изобилни карактеристики, соодветно (слики 4A–B, дополнителни сетови на податоци 9–12). Ги забележавме очекуваните разлики во потписите поврзани со саркомерите (на пр., тропомиозин и тропонин), спојувањето на ексцитација-контракција (SERCA изоформи) и енергетскиот метаболизам (на пр., ALDOA и CKB). Покрај тоа, транскриптите и протеините што ја регулираат убиквитинацијата на протеините беа диференцијално експресирани во брзо- и бавно-контрактивни влакна (на пр., USP54, SH3RF2, USP28 и USP48) (слики 4A–B). Покрај тоа, генот на микробниот протеин RP11-451G4.2 (DWORF), за кој претходно беше покажано дека е диференцијално експресиран кај типовите мускулни влакна кај јагнешкото месо43 и ја зголемува активноста на SERCA во срцевиот мускул44, беше значително зголемен кај бавните скелетни мускулни влакна (Слика 4A). Слично, на ниво на индивидуални влакна, беа забележани значајни разлики во познатите потписи како што се изоформите на лактат дехидрогеназа поврзани со метаболизмот (LDHA и LDHB, Слика 4C и Дополнителна слика 8A)45,46, како и претходно непознати потписи специфични за типот на влакна (како што се IRX3, USP54, USP28 и DPYSL3) (Слика 4C). Имаше значително преклопување на диференцијално експресираните карактеристики помеѓу транскриптомските и протеомските збирки на податоци (Дополнителна слика 8B), како и корелација на промена на превиткувањето главно предизвикана од поизразената диференцијална експресија на саркомерните карактеристики (Дополнителна слика 8C). Имено, некои потписи (на пр. USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) покажаа силна пост-транскрипциска регулација само на протеомско ниво и имаа бавно/брзо контракциони влакна специфични за типот на експресија (Дополнителна слика 8C).
А и Б вулкански дијаграми кои споредуваат бавни и брзи кластери идентификувани со графикони со униформна многуобразна апроксимација и проекција (UMAP) на сликите 1G–H. Обоените точки претставуваат транскрипти или протеини кои се значително различни при FDR < 0,05, а потемните точки претставуваат транскрипти или протеини кои се значително различни при логаритамска промена > 1. Двонасочна статистичка анализа е извршена со користење на DESeq2 Wald тестот со p-вредности прилагодени од Benjamini-Hochberg (транскриптомика) или методот на линеарен модел Limma со емпириска Баесова анализа проследена со Benjamini-Hochberg прилагодување за повеќекратни споредби (протеомика). C Дијаграми на потпис на избрани диференцијално експресирани гени или протеини помеѓу бавни и брзи влакна. D Анализа на збогатување на значително диференцијално експресирани транскрипти и протеини. Преклопувачките вредности се збогатени во двата сета податоци, вредностите на транскриптомите се збогатени само во транскриптомот, а вредностите на протеомите се збогатени само во протеомот. Статистичката анализа е извршена со користење на пакетот clusterProfiler со p-вредности прилагодени од Benjamini-Hochberg. E. Транскрипциски фактори специфични за типот на влакна идентификувани од SCENIC врз основа на резултатите од специфичноста на регулаторот добиени од SCENIC и диференцијалната експресија на mRNA помеѓу типовите влакна. F. Профилирање на избрани транскрипциски фактори диференцијално експресирани помеѓу бавните и брзите влакна.
Потоа извршивме анализа на пререпрезентација на диференцијално претставени гени и протеини (Слика 4D, Дополнителен сет на податоци 13). Збогатувањето на патеките за карактеристики што се разликуваа помеѓу двата сета на податоци откри очекувани разлики, како што се процесите на β-оксидација на масни киселини и метаболизам на кетони (бавни влакна), контракција на миофиламенти/мускули (брзи и бавни влакна, соодветно) и катаболни процеси на јаглехидрати (брзи влакна). Активноста на серин/треонин протеин фосфатазата беше исто така зголемена кај брзите влакна, водена од карактеристики како што се регулаторните и каталитичките фосфатазни подгрупи (PPP3CB, PPP1R3D и PPP1R3A), за кои е познато дека го регулираат метаболизмот на гликогенот (47) (Дополнителни слики 8D–E). Други патишта збогатени со брзи влакна вклучуваат процесирачки (P-) тела (YTHDF3, TRIM21, LSM2) во протеомот (Дополнителна слика 8F), потенцијално вклучени во пост-транскрипциската регулација (48) и активност на транскрипцискиот фактор (SREBF1, RXRG, RORA) во транскриптомот (Дополнителна слика 8G). Бавните влакна беа збогатени со активност на оксидоредуктаза (BDH1, DCXR, TXN2) (Дополнителна слика 8H), врзување за амиди (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Дополнителна слика 8I), екстрацелуларен матрикс (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Дополнителна слика 8J) и активност на рецептор-лиганд (FNDC5, SPX, NENF) (Дополнителна слика 8K).
За да добиеме понатамошен увид во транскрипциската регулација што лежи во основата на карактеристиките на типот бавни/брзи мускулни влакна, извршивме анализа на збогатување на транскрипциските фактори користејќи SCENIC49 (Дополнителен сет на податоци 14). Многу транскрипциски фактори беа значително збогатени помеѓу брзите и бавните мускулни влакна (Слика 4E). Ова вклучуваше транскрипциски фактори како што е MAFA, кој претходно беше поврзан со брз развој на мускулни влакна,50 како и неколку транскрипциски фактори кои претходно не беа поврзани со генски програми специфични за типот на мускулни влакна. Меѓу нив, PITX1, EGR1 и MYF6 беа најзбогатените транскрипциски фактори кај брзите мускулни влакна (Слика 4E). Спротивно на тоа, ZSCAN30 и EPAS1 (исто така познати како HIF2A) беа најзбогатените транскрипциски фактори кај бавните мускулни влакна (Слика 4E). Во согласност со ова, MAFA беше експресиран на повисоки нивоа во UMAP регионот што одговара на брзите мускулни влакна, додека EPAS1 имаше спротивен модел на експресија (Слика 4F).
Покрај познатите гени што кодираат протеини, постојат бројни некодирачки РНК биотипови кои можат да бидат вклучени во регулирањето на човечкиот развој и болести. 51, 52 Во транскриптомските податочни групи, неколку некодирачки РНК покажуваат специфичност за типот на влакна (Слика 5А и Дополнителен сет на податоци 15), вклучувајќи го и LINC01405, кој е многу специфичен за бавните влакна и е пријавено дека е намален во мускулите кај пациенти со митохондријална миопатија. 53 Спротивно на тоа, RP11-255P5.3, што одговара на генот lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, покажува специфичност за типот на брзи влакна. И LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) и RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) покажуваат специфичност на скелетните мускули (Дополнителни слики 9A-B) и немаат познати контрактилни гени во нивната геномска околина од 1 Mb, што сугерира дека тие играат специјализирана улога во регулирањето на типовите влакна, а не во регулирањето на соседните контрактилни гени. Бавните/брзите профили на експресија специфични за типот на влакна на LINC01405 и RP11-255P5.3, соодветно, беа потврдени со употреба на RNAscope (Слики 5B-C).
A. Некодирачките РНК транскрипти се значително регулирани кај бавно и брзо контрактивните мускулни влакна. B. Репрезентативни слики од RNAscope што ја покажуваат специфичноста на типот на бавно и брзо контрактивни влакна на LINC01405 и RP11-255P5.3, соодветно. Скала = 50 μm. C. Квантификација на експресијата на некодирачки РНК специфична за типот на миофибер, како што е определено со RNAscope (n = 3 биопсии од независни лица, споредувајќи ги брзите и бавните мускулни влакна во рамките на секоја индивидуа). Статистичката анализа е извршена со користење на двостран Студентски t-тест. Графиконите во кутии ја покажуваат медијаната и првиот и третиот квартил, со мустаќи што покажуваат кон минималните и максималните вредности. D. Работен тек за идентификација на микробен протеин de novo (креиран со BioRender.com). E. Микробниот протеин LINC01405_ORF408:17441:17358 е специфично експресиран кај бавните скелетни мускулни влакна (n = 5 биопсии од независни учесници, споредувајќи ги брзите и бавните мускулни влакна кај секој учесник). Статистичката анализа беше извршена со користење на методот на линеарен модел на Лим во комбинација со емпириски Баесов пристап, проследен со методот Бенџамини-Хохберг за повеќекратни споредби со прилагодување на p-вредноста. Графиконите во квадрат ја прикажуваат медијаната, првиот и третиот квартил, со мустаќи што покажуваат кон максималните/минималните вредности.
Неодамна, студиите покажаа дека многу претпоставени некодирачки транскрипти кодираат транскрибирани микробни протеини, од кои некои ја регулираат мускулната функција. 44, 55 За да идентификуваме микробни протеини со потенцијална специфичност на типот на влакна, го пребаравме нашиот збир на податоци од 1000 влакна од протеоми користејќи прилагодена FASTA датотека што ги содржи секвенците на некодирачки транскрипти (n = 305) пронајдени во збирот на податоци од 1000 влакна од транскриптоми (Слика 5D). Идентификувавме 197 микробни протеини од 22 различни транскрипти, од кои 71 беа диференцијално регулирани помеѓу бавните и брзите скелетни мускулни влакна (Дополнителна слика 9C и Дополнителен збир на податоци 16). За LINC01405, беа идентификувани три микробни протеински производи, од кои еден покажа слична специфичност на бавните влакна како и неговиот транскрипт (Слика 5E и Дополнителна слика 9D). Така, го идентификувавме LINC01405 како ген што кодира микробен протеин специфичен за бавните скелетни мускулни влакна.
Развивме сеопфатен работен тек за протеомска карактеризација на поединечни мускулни влакна во голем обем и идентификувавме регулатори на хетерогеноста на влакната во здрави состојби. Го применивме овој работен тек за да разбереме како немалинските миопатии влијаат на хетерогеноста на скелетните мускулни влакна. Немалинските миопатии се наследени мускулни заболувања кои предизвикуваат мускулна слабост и, кај засегнатите деца, се јавуваат со низа компликации, вклучувајќи респираторен дистрес, сколиоза и ограничена подвижност на екстремитетите. 19,20 Типично, кај немалинските миопатии, патогените варијанти во гените како што е актин алфа 1 (ACTA1) резултираат со доминација на составот на миофибер од бавно контракциони влакна, иако овој ефект е хетероген. Еден значаен исклучок е тропонин Т1 немалинската миопатија (TNNT1), која има доминација на брзи влакна. Така, подоброто разбирање на хетерогеноста што лежи во основата на дисрегулацијата на скелетните мускулни влакна забележана кај немалинските миопатии може да помогне во разоткривањето на сложената врска помеѓу овие болести и типот на миофибер.
Во споредба со здравите контроли (n = 3 по група), миофилките изолирани од пациенти со немалинска миопатија со мутации во гените ACTA1 и TNNT1 покажаа изразена атрофија или дистрофија на миофилките (Слика 6А, Дополнителна табела 3). Ова претставуваше значителни технички предизвици за протеомска анализа поради ограничената количина на достапен материјал. И покрај ова, успеавме да детектираме 2485 протеини во 272 скелетни миофилки. По филтрирање на најмалку 1000 квантифицирани протеини по влакно, 250 влакна беа подложени на последователна биоинформатичка анализа. По филтрирањето, беа квантифицирани во просек 1573 ± 359 протеини по влакно (Дополнителна слика 10А, Дополнителни сетови на податоци 17-18). Имено, и покрај значителното намалување на големината на влакната, длабочината на протеомот кај примероците од пациенти со немалинска миопатија беше само умерено намалена. Покрај тоа, обработката на овие податоци со користење на нашите сопствени FASTA датотеки (вклучувајќи некодирачки транскрипти) ни овозможи да идентификуваме пет микробни протеини во скелетните миофилки од пациенти со немалинска миопатија (Дополнителен сет на податоци 19). Динамичкиот опсег на протеомот беше значително поширок, а вкупните протеини во контролната група добро корелираа со резултатите од претходната анализа на протеомот од 1000 влакна (Дополнителна слика 10B–C).
A. Микроскопски слики што покажуваат атрофија или дистрофија на влакната и преовладување на различни типови влакна врз основа на MYH кај ACTA1 и TNNT1 немалински миопатии (NM). Скала = 100 μm. За да се обезбеди репродуктивност на боењето кај пациенти со ACTA1 и TNNT1, три биопсии на пациенти беа обоени два до три пати (четири дела по случај) пред да се изберат репрезентативни слики. B. Пропорции на типови влакна кај учесниците врз основа на MYH. C. График со анализа на главните компоненти (PCA) на скелетните мускулни влакна кај пациенти со немалински миопатии и контролни групи. D. Скелетни мускулни влакна од пациенти со немалински миопатии и контролни групи проектирани на PCA график определен од 1000 влакна анализирани на Слика 2. На пример, вулкански дијаграми што ги споредуваат разликите помеѓу учесниците со ACTA1 и TNNT1 немалински миопатии и контролните групи, и помеѓу учесниците со ACTA1 и TNNT1 немалински миопатии. Обоените кругови означуваат протеини кои беа значително различни при π < 0,05, а темните точки означуваат протеини кои беа значително различни при FDR < 0,05. Статистичката анализа е извршена со користење на методот на линеарен модел на Лима и емпириските Баесови методи, проследено со прилагодување на p-вредноста за повеќекратни споредби со користење на методот Бенџамини-Хохберг. H. Анализа на збогатување на значително диференцијално експресирани протеини низ целиот протеом и во влакна од тип 1 и 2A. Статистичката анализа е извршена со користење на пакетот clusterProfiler и p-вредности прилагодени од Бенџамини-Хохберг. I, J. Графикони на анализата на главните компоненти (PCA) обоени со термини на екстрацелуларниот матрикс и митохондријалната генска онтологија (GO).
Бидејќи немалинските миопатии можат да влијаат на пропорцијата на типовите на миофибери што експресираат MYH во скелетните мускули,19,20 прво ги испитавме типовите на миофибери што експресираат MYH кај пациенти со немалински миопатии и контролни групи. Го одредивме типот на миофибер користејќи непристрасен метод претходно опишан за анализата со 1000 миофибер (Дополнителни слики 10D-E) и повторно не успеавме да идентификуваме чисти 2X миофибери (Слика 6B). Забележавме хетероген ефект на немалинските миопатии врз типот на миофибер, бидејќи двајца пациенти со ACTA1 мутации имаа зголемен пропорција на миофибери тип 1, додека двајца пациенти со TNNT1 немалинска миопатија имаа намален пропорција на миофибери тип 1 (Слика 6B). Всушност, експресијата на MYH2 и брзите тропонински изоформи (TNNC2, TNNI2 и TNNT3) беше намалена кај ACTA1-немалинските миопатии, додека експресијата на MYH7 беше намалена кај TNNT1-немалинските миопатии (Дополнителна слика 11A). Ова е во согласност со претходните извештаи за хетерогено менување на типот на миофибер кај немалинските миопатии.19,20 Ги потврдивме овие резултати со имунохистохемија и откривме дека пациентите со ACTA1-немалинска миопатија имаа преовладување на миофибери тип 1, додека пациентите со TNNT1-немалинска миопатија имаа спротивен модел (Слика 6A).
На ниво на протеом со единечни влакна, скелетните мускулни влакна од пациенти со ACTA1 и TNNT1 немалинска миопатија се групираа со мнозинството контролни влакна, при што влакната од TNNT1 немалинска миопатија генерално беа најтешко погодени (Слика 6C). Ова беше особено очигледно при цртање на графикони со анализа на главните компоненти (PCA) на псевдо-надуени влакна за секој пациент, при што пациентите 2 и 3 со TNNT1 немалинска миопатија се појавија најоддалечени од контролните примероци (Дополнителна слика 11B, Дополнителен сет на податоци 20). За подобро да разбереме како влакната од пациентите со миопатија се споредуваат со здравите влакна, користевме детални информации добиени од протеомска анализа на 1.000 влакна од здрави возрасни учесници. Проектиравме влакна од збирот на податоци за миопатија (пациенти со ACTA1 и TNNT1 немалинска миопатија и контролни единици) на PCA графиконот добиен од протеомската анализа од 1000 влакна (Слика 6D). Распределбата на типовите на MYH влакна по PC2 кај контролните влакна беше слична на распределбата на влакната добиена од протеомската анализа од 1000 влакна. Сепак, повеќето влакна кај пациенти со немалинска миопатија се поместија надолу по PC2, преклопувајќи се со здрави влакна со брзо контрахирање, без оглед на нивниот нативен тип на MYH влакна. Така, иако пациентите со ACTA1 немалинска миопатија покажаа поместување кон влакна од тип 1 кога беа квантифицирани со методи базирани на MYH, и ACTA1 немалинска миопатија и TNNT1 немалинска миопатија го поместија протеомот на скелетните мускулни влакна кон влакна со брзо контрахирање.
Потоа директно ја споредивме секоја група пациенти со здрави контроли и идентификувавме 256 и 552 диференцијално експресирани протеини кај ACTA1 и TNNT1 немалински миопатии, соодветно (Слика 6E–G и Дополнителна слика 11C, Дополнителен сет на податоци 21). Анализата на збогатување на гени откри координирано намалување на митохондријалните протеини (Слика 6H–I, Дополнителен сет на податоци 22). Изненадувачки, и покрај диференцијалната преовладување на типовите влакна кај ACTA1 и TNNT1 немалинските миопатии, ова намалување беше целосно независно од типот на влакна базиран на MYH (Слика 6H и Дополнителни слики 11D–I, Дополнителен сет на податоци 23). Три микробни протеини беа исто така регулирани кај ACTA1 или TNNT1 немалински миопатии. Два од овие микропротеини, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (исто така познат како LINC00598 или Lnc-FOXO1) и ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), покажаа различна изобилство само кај миофилките тип 1. Претходно беше објавено дека ENSG00000215483_TR14_ORF67 игра улога во регулацијата на клеточниот циклус. 56 Од друга страна, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (што одговара на LINC01798) беше зголемен кај миофилките тип 1 и тип 2A кај ACTA1-немалинската миопатија во споредба со здрави контроли (Дополнителна слика 12А, Дополнителен сет на податоци 24). Спротивно на тоа, рибозомските протеини во голема мера не беа засегнати од немалинската миопатија, иако RPS17 беше намален кај ACTA1 немалинската миопатија (Сл. 6E).
Анализата за збогатување, исто така, откри зголемена регулација на процесите на имунолошкиот систем кај ACTA1 и TNNT1 немалински миопатии, додека адхезијата на клетките беше исто така зголемена кај TNNT1 немалинска миопатија (Слика 6H). Збогатувањето на овие екстрацелуларни фактори беше одразено со протеините на екстрацелуларниот матрикс кои го поместуваат PCA во PC1 и PC2 во негативна насока (т.е. кон најпогодените влакна) (Слика 6J). Двете групи пациенти покажаа зголемена експресија на екстрацелуларни протеини вклучени во имунолошките одговори и механизмите за поправка на сарколемата, како што се анексините (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 и нивниот интерактивен протеин S100A1159 (Дополнителни слики 12B-C). Претходно е објавено дека овој процес е подобрен кај мускулните дистрофии60, но, според нашите сознанија, претходно не бил поврзан со немалински миопатии. Нормалната функција на овој молекуларен механизам е потребна за поправка на сарколемата по повреда и за фузија на новоформирани миоцити со миофлакна58,61. Така, зголемената активност на овој процес кај обете групи пациенти укажува на репаративен одговор на повреда предизвикана од нестабилност на миофиберот.
Ефектите од секоја немалинска миопатија беа добро корелирани (r = 0,736) и покажаа разумно преклопување (Дополнителни слики 11A–B), што укажува дека ACTA1 и TNNT1 немалинска миопатија имаат слични ефекти врз протеомот. Сепак, некои протеини беа регулирани само кај ACTA1 или TNNT1 немалинска миопатија (Дополнителни слики 11A и C). Профибротичниот протеин MFAP4 беше еден од најзголемените протеини кај TNNT1 немалинска миопатија, но остана непроменет кај ACTA1 немалинска миопатија. SKIC8, компонента на комплексот PAF1C одговорен за регулирање на транскрипцијата на HOX генот, беше намален кај TNNT1 немалинска миопатија, но не беше засегнат кај ACTA1 немалинска миопатија (Дополнителна слика 11A). Директната споредба на ACTA1 и TNNT1 немалинска миопатија откри поголеми намалувања на митохондријалните протеини и зголемување на протеините на имунолошкиот систем кај TNNT1 немалинска миопатија (Слика 6G–H и Дополнителни слики 11C и 11H–I). Овие податоци се во согласност со поголемата атрофија/дистрофија забележана кај TNNT1 немалинска миопатија во споредба со TNNT1 немалинска миопатија (Слика 6A), што укажува дека TNNT1 немалинска миопатија претставува потешка форма на болеста.
За да процениме дали набљудуваните ефекти од немалинската миопатија перзистираат на ниво на целиот мускул, извршивме масовна протеомска анализа на мускулни биопсии од истата кохорта на пациенти со немалинска миопатија на TNNT1 и ги споредивме со контролните групи (n = 3 по група) (Дополнителна слика 13А, Дополнителен сет на податоци 25). Како што се очекуваше, контролите беа тесно поврзани во анализата на главните компоненти, додека пациентите со немалинска миопатија на TNNT1 покажаа поголема варијабилност меѓу примероците слична на онаа што се гледа во анализата на единечни влакна (Дополнителна слика 13Б). Масовна анализа ги репродуцираше диференцијално експресираните протеини (Дополнителна слика 13C, Дополнителен сет на податоци 26) и биолошките процеси (Дополнителна слика 13D, Дополнителен сет на податоци 27) истакнати со споредување на поединечни влакна, но ја изгубивме способноста да правиме разлика помеѓу различни типови влакна и не успеавме да ги земеме предвид хетерогените ефекти на болеста низ влакната.
Земени заедно, овие податоци покажуваат дека протеомиката со еден миофибер може да ги разјасни клиничките биолошки карактеристики кои не се откриваат со целни методи како што е имуноблотирањето. Покрај тоа, овие податоци ги истакнуваат ограничувањата на користењето само на типизирање на актински влакна (MYH) за да се опише фенотипската адаптација. Всушност, иако префрлањето на типот на влакна се разликува помеѓу актинските и тропонинските немалински миопатии, обете немалински миопатии го одвојуваат типизирањето на MYH влакна од метаболизмот на скелетните мускулни влакна кон побрз и помалку оксидативен мускулен протеом.
Клеточната хетерогеност е клучна за ткивата да ги задоволат своите разновидни барања. Во скелетните мускули, ова често се опишува како типови влакна кои се карактеризираат со различни степени на производство на сила и замор. Сепак, јасно е дека ова објаснува само мал дел од варијабилноста на скелетните мускулни влакна, која е многу попроменлива, посложена и повеќеслојна отколку што се сметаше претходно. Технолошкиот напредок сега фрла светлина врз факторите што ги регулираат скелетните мускулни влакна. Всушност, нашите податоци сугерираат дека влакната од тип 2X можеби не се посебен подтип на скелетни мускулни влакна. Покрај тоа, ги идентификувавме метаболните протеини, рибозомалните протеини и протеините поврзани со клетките како главни детерминанти на хетерогеноста на скелетните мускулни влакна. Со примена на нашиот протеомски работен тек на примероци од пациенти со нематодна миопатија, дополнително покажавме дека типизацијата на влакна базирана на MYH не ја одразува целосно хетерогеноста на скелетните мускули, особено кога системот е нарушен. Всушност, без оглед на типот на влакна базирана на MYH, нематодната миопатија резултира со поместување кон побрзи и помалку оксидативни влакна.
Скелетните мускулни влакна се класифицирани уште од 19 век. Неодамнешните омички анализи ни овозможија да почнеме да ги разбираме профилите на експресија на различните типови на MYH влакна и нивните реакции на различни стимули. Како што е опишано овде, омичките пристапи имаат и предност на поголема чувствителност за квантификација на маркерите за типови на влакна отколку традиционалните методи базирани на антитела, без да се потпираме на квантификација на еден (или неколку) маркери за да дефинираме тип на скелетни мускулни влакна. Користевме комплементарни транскриптомски и протеомски работни процеси и ги интегриравме резултатите за да ја испитаме транскрипциската и пост-транскрипциската регулација на хетерогеноста на влакната кај човечките скелетни мускулни влакна. Овој работен процес резултираше со неуспех во идентификувањето на чисти влакна од типот 2X на ниво на протеини во vastus lateralis на нашата кохорта здрави млади мажи. Ова е во согласност со претходните студии за единечни влакна кои пронајдоа <1% чисти 2X влакна кај здрав vastus lateralis, иако ова треба да се потврди и кај други мускули во иднина. Разликата помеѓу откривањето на речиси чисти 2X влакна на ниво на mRNA и само мешани 2A/2X влакна на ниво на протеини е збунувачка. Експресијата на иРНК на изоформата на MYH не е циркадијална,67 што укажува дека е малку веројатно дека сме го „пропуштиле“ сигналот за почеток на MYH2 во навидум чисти 2X влакна на ниво на РНК. Едно можно објаснување, иако чисто хипотетичко, би можело да биде разликата во стабилноста на протеините и/или иРНК помеѓу изоформите на MYH. Всушност, ниедно брзо влакно не е 100% чисто за која било изоформа на MYH и не е јасно дали нивоата на експресија на иРНК на MYH1 во опсегот од 70-90% би резултирале со еднакво изобилство на MYH1 и MYH2 на ниво на протеини. Сепак, кога се разгледува целиот транскриптом или протеом, анализата на кластери може со сигурност да идентификува само два различни кластери што претставуваат бавни и брзи скелетни мускулни влакна, без оглед на нивниот прецизен состав на MYH. Ова е во согласност со анализите што користат транскриптомски пристапи со едно јадро, кои обично идентификуваат само два различни мионуклеарни кластери. 68, 69, 70 Понатаму, иако претходните протеомски студии идентификуваа влакна од тип 2X, овие влакна не се групираат одделно од останатите брзи влакна и покажуваат само мал број на различно изобилни протеини во споредба со другите типови влакна базирани на MYH. 14 Овие резултати сугерираат дека треба да се вратиме на погледот од почетокот на 20 век за класификацијата на мускулните влакна, кој ги делеше човечките скелетни мускулни влакна не во три различни класи базирани на MYH, туку во два кластера базирани на нивните метаболички и контрактилни својства. 63
Поважно е што хетерогеноста на миофилките треба да се разгледува по повеќе димензии. Претходните студии за „омика“ укажуваат на оваа насока, сугерирајќи дека скелетните мускулни влакна не формираат дискретни кластери, туку се распоредени по континуум. 11, 13, 14, 64, 71 Овде покажуваме дека, покрај разликите во контрактилните и метаболичките својства на скелетните мускули, миофилките можат да се разликуваат според карактеристиките поврзани со интеракциите клетка-клетка и механизмите на транслација. Всушност, откривме хетерогеност на рибозомите во скелетните мускулни влакна што придонесува за хетерогеност независно од типовите на бавни и брзи влакна. Основната причина за оваа значителна хетерогеност на миофилките, независно од типот на бавни и брзи влакна, останува нејасна, но може да укажува на специјализирана просторна организација во мускулните снопчиња кои оптимално реагираат на специфични сили и оптоварувања, 72 специјализирана клеточна или органско-специфична комуникација со други типови на клетки во мускулната микросредина 73,74,75 или разлики во активноста на рибозомите во рамките на поединечните миофилки. Всушност, рибозомската хетероплазмија, или преку паралогна супституција на RPL3 и RPL3L или на ниво на 2′O-метилација на rRNA, е поврзана со хипертрофија на скелетните мускули76,77. Мулти-омските и просторните апликации во комбинација со функционална карактеризација на поединечни миофлакси дополнително ќе го унапредат нашето разбирање на мускулната биологија на мулти-омско ниво78.
Со анализа на протеомите на единечни миофибри од пациенти со немалински миопатии, исто така ја демонстриравме корисноста, ефикасноста и применливоста на протеомиката на единечни миофибри за да се разјасни клиничката патофизиологија на скелетните мускули. Покрај тоа, со споредување на нашиот работен тек со глобалната протеомска анализа, бевме во можност да демонстрираме дека протеомиката на единечни миофибри дава иста длабочина на информации како и глобалната ткивна протеомика и ја проширува оваа длабочина со земање предвид на хетерогеноста меѓу влакната и типот на миофибри. Покрај очекуваните (иако променливи) разлики во односот на типот на влакна забележани кај ACTA1 и TNNT1 немалински миопатии во споредба со здрави контроли,19 исто така забележавме оксидативно и екстрацелуларно ремоделирање независно од MYH-посредуваното префрлување на типот на влакна. Фиброзата претходно е пријавена кај TNNT1 немалински миопатии.19 Сепак, нашата анализа се темели на ова откритие, откривајќи и зголемени нивоа на екстрацелуларни секретирани протеини поврзани со стрес, како што се анексините, вклучени во механизмите за поправка на сарколемата, кај миофилките од пациенти со ACTA1 и TNNT1 немалински миопатии.57,58,59 Како заклучок, зголемените нивоа на анексин во миофилките од пациенти со немалинска миопатија може да претставуваат клеточен одговор за поправка на тешко атрофични миофилки.
Иако оваа студија претставува најголема анализа на омиката на целиот мускул на едно влакно кај луѓето досега, таа не е без ограничувања. Изолиравме скелетни мускулни влакна од релативно мал и хомоген примерок на учесници и еден мускул (vastus lateralis). Затоа, невозможно е да се исклучи постоењето на специфични популации на влакна низ мускулните типови и во екстремите на мускулната физиологија. На пример, не можеме да ја исклучиме можноста за подмножество на ултрабрзи влакна (на пр., чисти 2X влакна) што се појавуваат кај високо обучени спринтери и/или спортисти за сила79 или за време на периоди на мускулна неактивност66,80. Понатаму, ограничената големина на примерокот на учесниците нè спречи да ги истражиме половите разлики во хетерогеноста на влакната, бидејќи е познато дека соодносите на типовите влакна се разликуваат помеѓу мажите и жените. Понатаму, не можевме да спроведеме транскриптомски и протеомски анализи на истите мускулни влакна или примероци од истите учесници. Додека ние и другите продолжуваме да ги оптимизираме анализите на единечни клетки и единечни миофибери користејќи омична анализа за да постигнеме ултра низок внес на примероци (како што е прикажано овде во анализата на влакна од пациенти со митохондријална миопатија), станува очигледна можноста за комбинирање на мулти-омични (и функционални) пристапи во рамките на единечни мускулни влакна.
Генерално, нашите податоци ги идентификуваат и објаснуваат транскрипциските и пост-транскрипциските фактори кои влијаат на хетерогеноста на скелетните мускули. Поточно, презентираме податоци кои ја оспоруваат долгогодишната догма во физиологијата на скелетните мускули поврзана со класичната дефиниција за типовите влакна базирана на MYH. Се надеваме дека ќе ја обновиме дебатата и на крајот ќе го преиспитаме нашето разбирање за класификацијата и хетерогеноста на скелетните мускулни влакна.
Четиринаесет учесници од бела раса (12 мажи и 2 жени) доброволно се согласија да учествуваат во оваа студија. Студијата беше одобрена од Етичкиот комитет на Универзитетската болница во Гент (BC-10237), се придржуваше до Хелсиншката декларација од 2013 година и беше регистрирана на ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Општите карактеристики на учесниците се прикажани во Дополнителната табела 1. По добивањето усна и писмена информирана согласност, учесниците беа подложени на медицински преглед пред конечното вклучување во студијата. Учесниците беа млади (22-42 години), здрави (без медицински состојби, без историја на пушење) и умерено физички активни. Максималното внесување кислород беше определено со помош на степ-ергометр за проценка на физичката кондиција како што е опишано претходно. 81
Примероците од мускулна биопсија беа собрани три пати во мирување и на гладно, со растојание од 14 дена. Бидејќи овие примероци беа собрани како дел од поголема студија, учесниците консумираа плацебо (лактоза), антагонист на H1-рецепторите (540 mg фексофенадин) или антагонист на H2-рецепторите (40 mg фамотидин) 40 минути пред биопсијата. Претходно покажавме дека овие антагонисти на хистаминските рецептори не влијаат на кондицијата на скелетните мускули во мирување81, и не беше забележано групирање поврзано со состојбата во нашите графикони за контрола на квалитетот (Дополнителни слики 3 и 6). Стандардизирана исхрана (41,4 kcal/kg телесна тежина, 5,1 g/kg телесна тежина јаглехидрати, 1,4 g/kg телесна тежина протеини и 1,6 g/kg телесна тежина масти) се одржуваше 48 часа пред секој експериментален ден, а стандардизиран појадок (1,5 g/kg телесна тежина јаглехидрати) се консумираше наутро на експерименталниот ден. Под локална анестезија (0,5 ml 1% лидокаин без епинефрин), мускулни биопсии беа земени од мускулот vastus lateralis со употреба на перкутана Бергстромова аспирација.82 Мускулните примероци беа веднаш вградени во RNAlater и складирани на 4°C до рачна дисекција на влакната (до 3 дена).
Свежо изолираните снопови миофибер беа префрлени во свеж RNAlater медиум во сад за култура. Поединечните миофибери потоа беа рачно дисецирани со стереомикроскоп и фини пинцети. Дваесет и пет влакна беа дисецирани од секоја биопсија, обрнувајќи посебно внимание на изборот на влакна од различни области на биопсијата. По дисекцијата, секое влакно беше нежно потопено во 3 μl пуфер за лиза (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) што содржи ензими протеиназа К и DNase за отстранување на несаканите протеини и ДНК. Лизата на клетките и отстранувањето на протеините/ДНК потоа беа започнати со кратко вртложење, вртење на течноста во микроцентрифуга и инкубација на собна температура (10 мин). Лизатот потоа беше инкубиран во термички циклатор (T100, Bio-Rad) на 37°C за 5 мин, 75°C за 5 мин, а потоа веднаш складиран на -80°C до понатамошна обработка.
Полиаденилирани РНК библиотеки компатибилни со Illumina беа подготвени од 2 µl миофибер лизат со користење на комплетот за подготовка на библиотеката QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq (Lexogen). Деталните методи може да се најдат во упатството на производителот. Процесот започнува со синтеза на cDNA од прва нишка со обратна транскрипција, за време на која се воведуваат уникатни молекуларни идентификатори (UMI) и i1 баркодови специфични за примерокот за да се обезбеди здружување на примероците и да се намали техничката варијабилност за време на обработката низводно. cDNA од 96 миофилки потоа се здружува и прочистува со магнетни зрна, по што се отстранува РНК и се врши синтеза на втора нишка со користење на случајни прајмери. Библиотеката се прочистува со магнетни зрна, се додаваат i5/i7 ознаки специфични за групата и се амплификува PCR. Последниот чекор на прочистување произведува библиотеки компатибилни со Illumina. Квалитетот на секој збир на библиотека беше оценет со користење на комплетот за анализа на ДНК со мала фрагментација со висока чувствителност (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Врз основа на квантификацијата на Qubit, групите беа дополнително групирани во еквимоларни концентрации (2 nM). Добиениот групи потоа беше секвенциониран на инструмент NovaSeq 6000 во стандарден режим со користење на комплетот за реагенси NovaSeq S2 (1 × 100 нуклеотиди) со оптоварување од 2 nM (4% PhiX).
Нашиот процес на анализа е базиран на процесот на анализа на податоци QuantSeq Pool на Lexogen (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Податоците прво беа демултиплексирани со bcl2fastq2 (v2.20.0) врз основа на индексот i7/i5. Читањето 2 потоа беше демултиплексирано со idemux (v0.1.6) врз основа на баркодот од примерокот i1, а UMI секвенците беа извлечени со umi_tools (v1.0.1). Читањата потоа беа скратени со cutadapt (v3.4) во повеќе рунди за да се отстранат кратките читања (<20 во должина) или читањата што се состојат само од адаптерски секвенци. Читањата потоа беа усогласени со човечкиот геном користејќи STAR (v2.6.0c), а BAM датотеките беа индексирани со SAMtools (v1.11). Дупликатните читања беа отстранети со користење на umi_tools (v1.0.1). Конечно, броењето на усогласувањето беше извршено со користење на featureCounts во Subread (v2.0.3). Контролата на квалитетот беше извршена со користење на FastQC (v0.11.9) во неколку средни фази од цевководот.
Целата понатамошна биоинформатичка обработка и визуелизација беа извршени во R (v4.2.3), првенствено користејќи го работниот тек на Seurat (v4.4.0).83 Затоа, поединечните UMI вредности и матриците на метаподатоци беа трансформирани во Seurat објекти. Гените експресирани во помалку од 30% од сите влакна беа отстранети. Примероците со низок квалитет беа отстранети врз основа на минимален праг од 1000 UMI вредности и 1000 детектирани гени. На крајот, 925 влакна ги поминаа сите чекори за филтрирање на контрола на квалитетот. UMI вредностите беа нормализирани со користење на методот Seurat SCTransform v2,84 вклучувајќи ги сите 7418 детектирани карактеристики, а разликите меѓу учесниците беа регресирани. Сите релевантни метаподатоци може да се најдат во Дополнителниот сет на податоци 28.